J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S受体功能而调节NSCLC线粒体代谢

人类心脏病展现出新强大而适合于的叶绿体生物合成，无论如何是由大肠其组织的高碳特质引致的。由于活特质碳(ROS)的填充是这种生物合成的副副产品，因此需要以乙酰腺嘌呤二核苷乙酸磷乙酸(NADPH)的多种形式来减缓碳化应激，以促使这种叶绿体活特质的减弱。乙酰单核苷乙酸转移肽(NNT)可通过NADPH的填充来维系叶绿体的抗碳化必须，但其在非小细胞会心脏病(NSCLC)中会的功用已经无论如何。本数据分析推测NNT的表示在心脏病肠道三维中会相对来说减弱了的逐步形成和摧残特质。另皆，全面数据分析推测NNT遗漏就会所致叶绿体功用障碍，这与碳化应激的大量增高无关，而是以介导亚基的活特质减缓为标志。这些局限特质与NADPH的理论上和ROS的受益有关，这无论如何NNT在去除这些关键亚基类似物的碳化中会起着关键人物。

次测试方法

许多常见的心脏病肠道三维是并用C57BL6/J肠道的驯养策略而创设。寻常的是，这些肠道空投纯合皆显子7-11的框内遗漏以及叶绿体中会Nnt脱氧核糖核酸的错义甲基化所致非功用亚基的表示。因此，可以并用这种自然遗漏的等位基因(NntΔex7-11)来口碑NNT对心脏病再次发生的不良影响。

首先，运用于Kras甲基化(LSL-KrasG12D/+)招致的心脏病三维来探测Nnt表示对心脏病再次发生的不良影响。空投Cre改组肽的腺病毒接种LSL-KrasG12D/+肠道，可抑止KrasG12D在大肠上皮中会的表示和大肠脑瘤的逐步形成。并用LSL-KrasG12D/+肠道和C57BL6/J肠道交配去除Nnt+/+表示肠道或NntΔex7-11/Δex7-11表示肠道(示意图1A-1B)。该三维中会Nnt的表示所致Cre改组肽诱发的负载加快3个月(示意图1C-1D)。然后，并用Kras甲基化与p53遗漏同时表示(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)创设心脏病三维。Nnt的表示未扭曲Cre抑止的KP肠道的成功率(示意图1E)。寻常的是，在这个三维中会，p53的遗漏去除了Nnt表示对心脏病逐步形成的不良影响，并且无论Nnt表示如何，实验终究都存在相对来说的负载(示意图1F)。心脏病负载数量的量化在各有不同突变肠道二者之间未歧异(示意图1G-1H)。

虽然各有不同突变肠道二者之间的负载未歧异，但无论如何通过观察到三维中会摧残特质的歧异。我们推测Nnt+/+肠道中会51.3%的为3级(脑瘤)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11肠道中会仅有36.5%和38.8%的是高级(示意图1I)。Nnt+/+肠道再次发生4级的频率特别是在增高，推论了摧残特质的变化(示意图1J)。总之，这些信息无论如何Nnt有助于了心脏病的再次发生和摧残。

2 NNT的遗漏不不良影响叶绿体中会硫碳还亚基(TXN)的抗碳化体系

为了全面评量NNT对心脏病生物学的不良影响，首先评量shRNA妨碍NNT亚基的表示，包括4个表示NNT亚基的NSCLC细胞会系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表示NNT亚基的H441细胞会(示意图2A)。妨碍NNT亚基表示抑制NSCLC细胞会的增殖必须(示意图2B)。并且推测极快病毒接种4天后NNT的下调减缓了H2009和PC9细胞会的生存必须(示意图2C)。此皆，H441细胞会的增殖不受NNT的不良影响。

不一定认为NNT有助于NADPH的浓缩必须，从而维系叶绿体亚基抗碳化系统会始终保持浓缩仅仅(示意图2D)。妨碍NNT减缓了H1299、H2009和PC9细胞会中会NADPH: NADP+的数量 (示意图2E)。极快病毒接种4天后叶绿体中会H2O2特别是在增高(示意图2F)，所以NNT对H2O2解毒剂全过程很不可忽视。

为了考虑这些叶绿体ROS的增高无论如何与叶绿体抗碳化系统会有关，于是并用Western blotting评量叶绿体中会过碳化物亚基3(PRDX3)的碳化仅仅。H2O2通过PRDX3解毒剂，即一对半胱氨乙酸多肽抑止PRDX3逐步形成二聚体，并且不必通过TXN浓缩这些半胱氨乙酸多肽才能浓缩PRDX3的抗碳化功用。PRDX3二聚体的受益是PRDX3碳化的标志，是叶绿体碳化应激的会用标志物。

奥拉诺芬是一种TXN浓缩肽(TRXR)酶抑制剂，虽然奥拉诺芬的化疗就会所致PRDX3亚基大量碳化，但NNT的遗漏并未增高PRDX3的碳化(示意图2G)。此皆，NNT的遗漏也未减缓叶绿体TXN2或TRXR2的亚基高水平。总之，这些结果无论如何NNT在NSCLC表征必须上发挥不可忽视功用，但NNT活特质的失掉并不就会侵害叶绿体TXN抗碳化系统会，也不就会招致相对来说的碳化应激。

3 NNT的遗漏就会侵害叶绿体的碳化必须

鉴于NNT在IMM中会的导向及其不良影响薄膜上质子变化率和浓缩必须，于是试示意图阐述NNT对叶绿体碳化生物合成无论如何不可忽视。首先，运用于天鹅细胞会皆变化率深入数据分析仪来进行叶绿体压力次测试，评量NNT遗漏对一般叶绿体碳化功用的不良影响。结果推测NNT遗漏细胞会的耗碳量(OCR) 随叶绿体酶抑制剂的依次传递而被增大(示意图3A)。例皆的是，NNT遗漏细胞会的较大吞咽必须在不意味着非耦合吞咽的情况特别是在减缓(示意图3B)。这上会叶绿体碳化局限特质与NNT对质子局部的不良影响无关。鉴于NNT遗漏相对来说不良影响吞咽必须，于是探测NNT遗漏的H441细胞会无论如何比NNT表示细胞会具相当多的碳化和更强的NADH必须。这说明这些细胞会在未NNT的情况无论如何通过叶绿体NADPH来源不明而维系叶绿体的功用。

叶绿体的碳化生物合成意味着ETC的功用，ETC由介导电子传递的Fe-S亚基亚基组成。考虑Fe-S亚基亚基的生物人工合成全过程需要NADPH，于是数据分析NNT妨碍后叶绿体吞咽功用的下降无论如何与Fe-S亚基涉及。叶绿体压力次测试可以对吞咽功用来进行一般特质的深入数据分析，但不可以对单个ETC亚基成分来进行评量。因此，作者来进行了更各个领域的实验来深入数据分析Fe-S亚基依赖的吞咽涉及亚基(I, II, III)。结果推测，基于亚基I(乙酸和苹果乙酸)的摄取，在NNT妨碍后亚基I-III的活特质特别是在减缓(示意图3C)。此皆，NNT局限特质细胞会相对来说减缓了琥珀乙酸的OCR，无论如何减缓了琥珀乙酸脱氢肽(SDH)活特质和亚基II-III流量(示意图3D)。所致这一周期性的不可忽视状况是SDH在ETC和TCA周而复始中会扮演着双重反派。

除了通过ETC维系放电量皆，Fe-S亚基还维系对碳化生物合成至关不可忽视的其他亚基肽的功用。为了考虑NNT无论如何参加其他Fe-S亚基的功用，作者评量了TCA周而复始中会Fe-S亚基——顺大黄乙酸肽(ACO2)的活特质。结果推测妨碍NNT特别是在减缓了NSCLC细胞会系中会ACO2的活特质(示意图3E)。ACO2活特质的减缓无论如何就会受到破坏TCA周而复始，进而增大驱动ETC流量的浓缩特质物质的填充。为了不足之处非小细胞会心脏病中会ACO2功用的深入数据分析，于是口碑Nnt表示对KP心脏病中会ACO2活特质的不良影响。结果无论如何，Nnt+/+肠道中会Aco2活特质相对来说略低于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11中会的，不足Nnt的展现出新最低的活特质(示意图3F)。

4 皆源特质NADPH在NNT遗漏后维系Fe-S亚基功用

为了考虑与妨碍NNT涉及的叶绿体Fe-S亚基功用的减缓无论如何与NADPH:NADP+的减缓有关，我们试示意图获取一种叶绿体NADPH的皆源特质来源不明。为了意味着这一能够，我们选择了糖类叶绿体中会NADH激肽pos5p，它可以磷乙酸化NADH而去除NADPH。虽然pos5p基本上在细菌中会也有皆源表示，但据我们所知，pos5p还未被加进类动物系统会。为了探测我们无论如何必须有效在人类NSCLC细胞会的叶绿体中会表示pos5p亚基，我们对糖类亚基来进行了上标，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9细胞会的叶绿体中会出乎意料表示了HA-tag上标的pos5p亚基(示意图4A)。选择这些细胞会系是为了评量pos5p修复和NNT遗漏涉及的Fe-S亚基局限特质的必须，推测妨碍NNT后对它们引致很更为严重的不良影响。

pos5p的表示力挽狂澜了细胞会中会妨碍NNT后招致的NADPH: NADP+数量的增大(示意图4B)。这与表示pos5p细胞会中会pos5p扰后吞咽支链适合于大型活动的增大有关(示意图4C和4D)。此皆，pos5p的表示仅仅力挽狂澜了NNT妨碍后ACO2活特质的下降(示意图4E)。总之，这些信息无论如何维系NNT表示遗漏时NADPH的高水平可以保障NSCLC细胞会中会Fe-S亚基的功用。

5 NNT的遗漏不就会受到破坏Fe-S亚基的生物人工合成

考虑叶绿体皆源特质NADPH必须消散NNT遗漏涉及Fe-S亚基的局限特质，并且NADPH是高效维系Fe-S亚基生物人工合成的必备条件，因此我们年中试示意图考虑NNT活特质无论如何维系这一全过程。Fe-S亚基生物人工合成再次发生在一个由半胱氨乙酸脱硫肽(NFS1)和Fe-S螺栓亚基(ISCU)组成的多亚基亚基中会。亚基中会任何一种成分的遗漏都就会不良影响生物人工合成，并且也与叶绿体局限特质涉及。因此，我们妨碍NFS1或ISCU表示来数据分析受到破坏Fe-S亚基生物人工合成后对吞咽支链和ACO2的不良影响。

在H2009细胞会中会，妨碍NFS1后特别是在减缓乙酸/苹果乙酸反应会和琥珀乙酸反应会中会吞咽支链亚基I-III的活特质，而在PC9细胞会中会只有亚基II-III活特质被相对来说减缓(示意图5A和5B)。另皆，两个细胞会系中会，在乙酸/苹果乙酸和琥珀乙酸的功用下，妨碍ISCU表示后特别是在消散了OCR(示意图5A和5B)。并且妨碍NFS1或ISCU后特别是在减缓了细胞会系中会ACO2活特质(示意图5C)。寻常的是，NNT妨碍后所招致的局限特质与Fe-S亚基生物人工合成所需物质引致的局限特质是同等不可忽视的(示意图5A-5C)。

为了推论Fe-S亚基局限特质对NSCLC细胞会的叶绿体生物合成有功用特质不良影响，我们对妨碍NNT或ISCU细胞会来进行基于色谱法色谱-高分辨分析化学(LC-HRMS)的生物合成组学数据分析。 对这些细胞会TCA周而复始的生物合成物来进行深入数据分析，结果显示大多数中会间副产品的核素再次发生了特别是在变化(示意图5D)。这些都无论如何了碳化生物合成的更为严重受到破坏和Fe-S亚基功用局限特质的一致特质。具体地说就是妨碍NNT和ISCU表示后，乙酸、苹果乙酸和富马乙酸被剩余。NNT遗漏细胞会中会的柠檬乙酸高水平被剩余，但妨碍ISCU细胞会中会并未此结果。另皆，妨碍ISCU细胞会中会琥珀乙酸大量受益，而在NNT遗漏细胞会中会则不存在此周期性(示意图5D)。

除了Fe-S亚基ACO2和SDH皆，TCA周而复始还意味着另一种叶绿体Fe-S亚基——水解肽乙酸人工合成肽(LIAS)的功用。LIAS对于水解肽乙酸的人工合成以及不可忽视水解肽乙硼基团的共轭都比较关键，水解肽乙硼基团由PDH (E2)和α-酮戊二乙酸脱氢肽(二氢水解肽酰胺S-琥珀酰转移肽，DLST)组成。LIAS对Fe-S亚基生物人工合成的受到破坏特别恰当，因为其Fe-S簇在催化全过程中会被剩余掉，这就建议不停地来进行亚基交换。事实上，妨碍NFS1和ISCU表示就会大量增大PC9细胞会中会PDH-E2和DLST的脂化，然而妨碍NNT对亚基脂化无不良影响(示意图5E)。总的来说，这些信息无论如何，NNT随之而来肽和生物合成局限特质，它们的局限特质与Fe-S亚基生物人工合成的受到破坏涉及，但NNT不无论如何直接不良影响这一全过程。这反映出新妨碍NNT和ISCU后对TCA周而复始去除类似但又各有不同的不良影响。

6 NNT的遗漏受到破坏葡萄糖生物合成

除了剩余TCA周而复始皆，NNT局限特质细胞会的LC-HRMS生物合成组学深入数据分析无论如何葡萄糖生物合成痉挛。妨碍NNT有助于长支链胆固醇芳基甘氨乙酸的大量受益，而长支链胆固醇芳基甘氨乙酸是葡萄糖β-碳化的底物(示意图6A)。鉴于在NNT局限特质细胞会中会存在吞咽系统会局限特质，我们推测这些芳基甘氨乙酸的增高是由于葡萄糖碳化增大。我们推测在H1299和PC9细胞会中会OCR与菠萝乙硼的碳化有关，妨碍NNT后OCR减缓(示意图6B)。我们还通过观察到NNT局限特质细胞会中会饱和葡萄糖和不饱和葡萄糖均大量受益(示意图6C)。葡萄糖人工合成需要剩余大量NADPH，而且NNT妨碍后NADPH的理论上减缓，于是我们认为这些葡萄糖高水平的增高是由于皆源特质葡萄糖摄入的增高。另皆，我们推测，NNT局限特质细胞会减弱了对电子显微镜菠萝乙酸类似物的吸收必须(示意图6D)。为了口碑NNT妨碍后葡萄糖的受益无论如何是一个潜在的不利因素，我们运用于饱和葡萄糖菠萝乙酸酯性刺激NNT局限特质细胞会24小时，推测NNT妨碍后使H1299和H2009细胞会对菠萝乙硼恰当(示意图6E)。此皆，NNT妨碍后特别是在提高了H1299和PC9细胞会对单一不饱和葡萄糖油乙硼的恰当特质(示意图6F)。鉴于皆源特质葡萄糖不足之处的有害不良影响，我们预定细胞会皆骨骼肌剩余将保障NNT的遗漏。实在太惊讶的是，培养基中会的骨骼肌剩余加剧了NNT的下调(示意图6G)。更不可忽视的是，NNT妨碍后细胞会皆骨骼肌毕竟就会增高NADPH的剩余(示意图6H)，这无论如何在不足皆源特质葡萄糖的情况暂时人工合成葡萄糖，使NNT局限特质细胞会中会NADPH的理论上减缓。总的来说，这些信息无论如何NNT无论如何在调节葡萄糖生物合成中会起不可忽视功用，NSCLC细胞会的葡萄糖生物合成紊乱无论如何是一个可并用的关键时刻。

7 NNT遗漏后叶绿体特异性过碳化氢肽(MitoCatalase)力挽狂澜Fe-S亚基功用

Fe-S亚基对分子碳和更多有害物质的碳化比较恰当。虽然我们未通过观察到叶绿体亚基抗碳化系统会的碳化仅仅再次变动，但这并不无关NNT妨碍后随之而来的叶绿体ROS足够将这些恰当特质类似物碳化。为了阐明这种无论如何特质，我们运用于了叶绿体特异性的过碳化氢肽(MitoCatalase)来减弱叶绿体的抗碳化必须。我们出乎意料地在H1299、H2009和PC9细胞会中会过表示了MitoCatalase (示意图7A)。MitoCatalase的表示也部分消散了NNT妨碍后涉及叶绿体中会H2O2的去除(示意图7B)。这与NNT妨碍后吞咽支链适合于大型活动的增大相对来说应(示意图7C和7D)。另皆，MitoCatalase的表示趋于稳定NNT妨碍后ACO2的活特质(示意图7E)。综上所述，这些信息无论如何，提高叶绿体解毒剂H2O2的必须可以消除NNT妨碍后Fe-S亚基再次发生局限特质，从而使NNT在消除Fe-S亚基再次发生碳化方面发挥功用，但对Fe-S簇的生物人工合成无功用。

结论

总之，我们的数据分析无论如何，NNT对心脏病生物学具不可忽视意义，主要是通过调控Fe-S亚基而有助于叶绿体生物合成。与以往口碑NNT功用的数据分析各有不同，我们详细描述了NNT对NSCLC中会叶绿体碳化浓缩稳态的细微不良影响。在NSCLC中会，NNT活特质无论如何去除了大量碳化生物合成招致的碳化应激反应会。我们的推测全面无论如何了叶绿体生物合成在心脏病再次发生中会的必要特质，说明叶绿体功用的减弱无论如何是心脏病化疗的一个不可忽视抗肿瘤。肽TPH-1对大肠保障起关键人物，无论如何作为化疗CKD的潜在化疗抗肿瘤。

原始出新处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.